Conociendo mejor a la toxina alfa
¿Por qué los científicos están investigando el papel de la
toxina alfa en el desarrollo de la enteritis necrótica? Dos
investigadores comparten sus puntos de vista sobre los
estudios que podrían impactar el manejo de la enteritis
necrótica, enfermedad grave y costosa.
Algunos estudios en los que se utilizó
tanto un kit de prueba de la toxina alfa
como la técnica de inmunohistoquímica,
presentan sólida evidencia de que esta
toxina desempeña un papel importante en
el desarrollo de la enteritis necrótica, de
acuerdo con lo dicho por la Dra. Joan
Schrader en el Congreso Avícola Mundial.
La toxina alfa es una proteína tóxica que
secreta la bacteria Clostridium perfringens y
que también es un componente de Netvax,
toxoide de C. perfringens tipo A, que
cuenta con licencia condicionada en
EE.UU. y que se administra a las
reproductoras para controlar la enteritis
necrótica en los pollos de engorde. Este
biológico fue desarrollado por Intervet/
Schering-Plough Animal Health, explicó
la Dra. Schrader, científica de la empresa.
El lanzamiento reciente de un kit
diagnóstico comercial a base de tiras
reactivas, diseñado para detectar C. perfringens y la toxina alfa en las heces,
proporciona una nueva herramienta para
evaluar el papel de la toxina alfa en el
desarrollo de la enteritis necrótica, agregó.
Esta investigadora también realizó pruebas
de inmunohistoquímica para demostrar
físicamente la presencia de la toxina alfa
en el sitio de la lesión.
Para esta prueba se utilizan anticuerpos
monoclonales adheridos a una tira de
papel, tanto contra C. perfringens tipo
A como contra su toxina alfa. Cuando
la tira se expone a estos antígenos
–presentes en las heces de pollo
solubilizadas– se desarrolla una línea
de color que demuestra la presencia de
C. perfringens tipo A, y una segunda
línea de color para la toxina alfa.
Detalles y resultados del estudio
Se utilizaron 52 pollos de engorde
comerciales de un día de edad que se
colocaron en el piso de los corrales de la unidad de investigación y desarrollo de la
compañía en Elkhorn, Nebraska, EE.UU.
Se alojaron 25 aves en un corral y el resto
en otro, como testigos.
Se les administró un alimento iniciador
no medicado durante los primeros 5 días,
para luego cambiar a una dieta alta en
proteína durante el resto del estudio.
Cuando cumplieron 19, 20 y 21 días
de edad, los animales experimentales
recibieron un desafío con C. perfringens
tipo A, por vía oral.
A los 23 días de edad se tomaron muestras
fecales directamente de la cloaca de cada
pollo y se analizaron de acuerdo con las
instrucciones del kit diagnóstico. Cada
muestra se analizó con tres tiras reactivas,
aclaró la doctora.
También se asignaron calificaciones a
sus lesiones de enteritis necrótica, que
luego se utilizaron para determinar la
prevalencia verdadera de esta enfermedad
y la capacidad de las tiras reactivas de
detectar a C. perfringens y a la toxina
alfa, subrayó.
La prevalencia general de pruebas
positivas a C. perfringens, según
la calificación de lesiones, fue 33%
para la calificación 0 (6/18), 18% para
la calificación 1 (14/78), 19% para
la calificación 2 (9/48), 61% para la
calificación 3 (11/18) y 88% para la
calificación 4 (16/18). La incidencia de
tiras de prueba positivas a C. perfringens
no fue diferente entre las aves positivas o negativas a enteritis necrótica (Cuadro
1), dijo Schrader.
Cuadro 1. La incidencia de resultados positivos con las tiras reactivas a C. perfringens no presentó
diferencias entre las aves positivas o negativas a enteritis necrótica
CP = Clostridium perfringens Nota = Sólo se detectó la toxina alfa en los pollos positivos a enteritis necrótica
NA = No se analizó
Las tiras no detectaron la presencia de
toxina alfa hasta que las calificaciones de
lesiones llegaron a 3 ó 4: El kit fue capaz
de detectar esta toxina en el 37% (7/18)
de las pruebas entre los pollos con
calificación 3 y en el 71% (13/18) de los
pollos con calificación 4, señaló.
El estudio mostró una buena relación
entre la calificación de lesiones y la
detección de toxina alfa, toda vez que
cuando la calificación era alta, aumentó la
detección de la toxina con el kit analítico.
Enfatizó la Dra. Schrader.
Además, el hallazgo de que las
calificaciones de lesiones elevadas
guardaban una relación positiva con
los resultados de la tira reactiva para
C. perfringens y toxina alfa en el sitio
de las lesiones de enteritis necrótica, “respalda la hipótesis de que la severidad
de las lesiones macroscópicas es
directamente proporcional al número de
C. perfringens presente y a la cantidad
de toxina alfa producida”, concluyó.
Resultados de
inmunohistoquímica
Posteriormente, la investigadora realizó
pruebas de inmunohistoquímica sobre las
lesiones de enteritis necrótica. Esta
técnica se ha utilizado ampliamente para
detectar la presencia de agentes patógenos
en los tejidos. Para realizarla se utiliza
un corte extremadamente delgado del
tejido, que se fija a un portaobjetos de
cristal, para observación al microscopio.
Posteriormente se agrega a la preparación
un anticuerpo teñido con fluoresceína,
que se une al antígeno correspondiente,
en caso de estar presente. En nuestro
estudio “observamos una clara unión positiva de los anticuerpos”, explicó la
doctora (véase la Figura 1).
Figura 1. El anticuerpo con pigmento
fluorescente se une al antígeno en cuestión,
en caso de estar presente.
Los resultados del presente estudio,
dijo, “demuestran fehacientemente la
participación de la toxina alfa en la
enteritis necrótica”.
Aun cuando este kit de prueba fue de
utilidad para los propósitos del estudio,
aclaró, tal vez no sea particularmente
aplicable en el campo para los productores
que estén tratando de detectar la enteritis
necrótica subclínica, que puede pasar
inadvertida, pero de todas maneras afecta
el rendimiento. La prueba sólo es capaz
de diagnosticar los casos clínicos de la
enfermedad, con calificaciones altas de
lesiones, pero “para entonces, ya será
evidente que las aves están enfermas”.
Un estudio en Estados
Unidos sugiere que la
toxina alfa desempeña
un papel como causante
de la enteritis necrótica
La vacunación del pollo de engorde con una toxina alfa
recombinante los protegió contra el desafío experimental con
Clostridium perfringens, sugiriendo que esta toxina desempeña
un papel en la patogenia de la enteritis necrótica.
En este estudio, los pollos se vacunaron subcutáneamente con una
toxina alfa recombinante a los 5 y 15 días de edad, y 10 días después
se desafiaron con C. perfringens, agente causal de la enteritis
necrótica. El desafío se administró dos veces al día durante 4 días
consecutivos, mezclando los cultivos de la bacteria con el alimento.
El 87.8% de las aves desafiadas que no se habían vacunado
desarrolló enteritis necrótica, pero sólo el 54.9% de las vacunadas
desarrolló lesiones. Además, los testigos no vacunados presentaron
calificaciones de lesiones que promediaron 2.37, en comparación con
1.35 en los pollos vacunados, de acuerdo con la publicación de K. K.
Cooper et al. de la Universidad de Arizona en Tucson, EE.UU., en el
número de junio de 2008 de la revista Veterinary Microbiology
(Microbiología Veterinaria).
La vacunación también produjo una respuesta de anticuerpos, pues
los títulos posvacunales contra la toxina alfa fueron más de 5 veces
superiores que en los pollos no vacunados. Después del desafío, las
aves vacunadas mostraron títulos promedio de IgG (IgY) más de 15
veces superiores a los de las aves no vacunadas, según explicaron
los investigadores.
Ahora ha resurgido la enteritis necrótica en las aves de corral debido
–en parte– a la prohibición del uso de los antibióticos promotores del
crecimiento que se administraban en la ración, pero de acuerdo con
los científicos, los resultados de este estudio sugieren que la toxina
alfa se puede utilizar como un inmunógeno efectivo y, como tal, puede
desempeñar un papel en la patogenia de la enteritis necrótica.
PRESCOTT: LA TOXINA ALFA
ESTIMULA EXCELENTE
PROTECCIÓN
CONTRA LA ENTERITIS
NECRÓTICA.
PROBABLEMENTE
ESTÉN INVOLUCRADAS
TAMBIÉN OTRAS
PROTEÍNAS
La investigación independiente realizada
por científicos canadienses utilizando
tecnología de vanguardia, confirma que
la toxina alfa –una proteína que secreta
Clostridium perfringens– desempeña un
papel clave en el desarrollo de la enteritis
necrótica en los pollos de engorde y que
probablemente otras proteínas también
participen en la patogenia de esta
compleja enfermedad.
La inmunización con el toxoide alfa
brindó protección casi total a los
pollos productores de carne contra esta
enfermedad, mientras que otras proteínas
secretadas por C. perfringens virulento
estimularon diversos grados de
inmunidad, dijo el Dr. John F. Prescott,
de la Universidad de Guelph, Ontario,
Canadá, en una reunión de la Asociación
de Veterinarios Especialistas en Aves de
aquella localidad (OAPP), celebrada a
principios del presente año en Guelph.
La enteritis necrótica se ha convertido
en una enfermedad de importancia
económica para la industria de los pollos
de asar. Aun cuando se sabe que la
causa es C. perfringens, no se conoce
exactamente la manera como esta bacteria
produce la enfermedad, explicó el
Dr. Prescott.
Se ha culpado principalmente a toxina
alfa; sin embargo, a principios del presente
año algunos investigadores australianos
publicaron un artículo sobre una nueva
toxina de C. perfringens, a la que llamaron
NetB. En muchas de las publicaciones de sus hallazgos, indicaron que esta toxina
era la principal causa de la enteritis
necrótica y, con base en sus cuidadosas
investigaciones, descontaron el papel de
la toxina alfa.
Estudio en Canadá
Sin embargo, las investigaciones realizadas
por el Dr. Prescott y sus colegas muestran
que la inmunización con la toxina alfa
brindó la mejor protección contra el
desafío severo con una cepa virulenta de
C. perfringens que contenía el gen NetB.
En sus estudios, presentados por el mismo
Dr. Prescott en la reunión de Ontario,
evaluó varias proteínas secretadas por la
citada bacteria y analizó su capacidad
de proteger a los pollos contra la cepa
virulenta. Estas proteínas fueron la toxina
alfa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,
la piruvato:ferredoxín oxidorreductasa
(PFOR), la fructosa 1,6-difosfato
aldolasa, y una quinta proteína denominada
hipotética (HP).
Los pollos se inmunizaron de dos a tres
veces con una de estas proteínas y después
de una semana de la última inmunización
fueron desafiados con la cepa virulenta en
el alimento, a las 4 semanas de edad.
Se presentaron diferencias en la severidad
de los desafíos. Por ejemplo, un desafío
suave consistió en la administración de la
cepa virulenta en el alimento tres veces al
día, durante 3 días, mientras que el más severo consistió en la administración de la
cepa virulenta en la ración, continuamente
durante 5 días. La severidad de cada
desafío se confirmó mediante calificación
de lesiones de enteritis necrótica en los
testigos no inmunizados, desafiados.
Todas las proteínas protegieron
significativamente a los pollos contra
el desafío relativamente suave, pero
cuando se administró el desafío severo,
la protección significativa se obtuvo con
la toxina alfa, la PFOR y la HP, reportó
el investigador.
La toxina alfa brindó la
mejor protección
Sin embargo, la mayor protección contra
el desafío severo se presentó en las aves
sensibilizadas previamente dos veces con
el toxoide alfa (un toxoide es una toxina
modificada de tal manera que pierde su
toxicidad pero sigue siendo capaz de
iniciar la inmunidad) y luego se reforzó
con la toxina activa purificada. El Dr.
Prescott y sus colaboradores reportaron lo
anterior en el estudio publicado en el
número de septiembre del año pasado de
la revista Clinical and Vaccine Immunology
(Inmunología Clínica y Vacunal).
Además, el suero y los lavados intestinales
de las aves protegidas tuvieron títulos
elevados de anticuerpos específicos contra
todas las proteínas utilizadas en el estudio,
de acuerdo con sus hallazgos.
Este fue el primer reporte en demostrar
la capacidad inmunizante de las proteínas
secretadas por C. perfringens contra la
enteritis necrótica en pollo de engorde,
de acuerdo con la publicación de Prescott
et al.
Concluyeron que existen ciertas
proteínas secretadas por la bacteria
–además de la toxina alfa– que participan
en la inmunidad de los pollos contra la
enteritis necrótica.
La proteína NetB puede ser
un marcador
El Dr. Prescott y su equipo también
utilizaron la reacción en cadena con
polimerasa (PCR) para probar a la cepa
virulenta de desafío, encontrando que era
positiva al gen NetB.
“El hecho de que la inmunización con la
toxina alfa haya protegido poderosamente
a las aves contra la enteritis necrótica
experimental causada por un aislamiento
que contenía a la proteína NetB, sugiere
que la toxina alfa realmente es crítica para
el desarrollo de esta enfermedad y que tal
vez la proteína NetB sólo se encargue de
iniciar la infección”, explicó.
“Sé bien que los investigadores australianos
consideran que el éxito de los
anticuerpos contra la toxina alfa en la
magnífica protección contra la enteritis
necrótica, se debe a que pueden interferir
con la secreción de todas las proteínas de
este microorganismo incluyendo –por
ejemplo– la secreción de NetB. Tal vez
esto sea difícil de demostrar, pero en
realidad no importa, toda vez que la inmunización con la toxina alfa funciona
tan bien”, agregó.
Además, algunas observaciones en
Ontario, no publicadas, muestran
que aislamientos no relacionados
genéticamente y procedentes de pollos
enfermos en parvadas con enteritis
necrótica “sistemáticamente resultaron
positivos a la proteína NetB, mientras
que los aislamientos de aves sanas en
el matadero por lo general resultaron
negativas a la proteína NetB”, comentó.
“La gran mayoría –aunque no todos–
los aislamientos [de C. perfringens]
procedentes de aves con enteritis necrótica
o de parvadas con esta enfermedad tiene
la proteína NetB, por lo que constituye
un buen marcador de las cepas de
C. perfringens causantes de enteritis
necrótica”, dijo el Dr. Prescott.
Cuando el reportero de la revista
Intestinal Health (Salud Intestinal) le
preguntó por qué se continúan realizando
investigaciones con otras proteínas
secretadas, cuando ya se ha demostrado
que la toxina alfa puede proteger a los
pollos de engorde contra la enteritis
necrótica, el Dr. Prescott explicó que
“será de gran ayuda para entender mejor
a la enteritis necrótica, aunque estoy de
acuerdo en que la toxina alfa debería ser
el principal foco de atención. Con base en
los hallazgos de protección de las aves
después de la inmunización, la toxina
alfa aparentemente desempeña un papel
central en este padecimiento”, aunque
el uso de más de una proteína puede
aportar ventajas.
Agregó que las proteínas tienen diferentes
actividades, incluyendo toxicidad, y
también existen diferencias en sus blancos
de acción.
A favor de la vacuna
Los métodos de control de la enteritis
necrótica pueden incluir el uso de
probióticos, para generar competencia
bacteriana contra C. perfringens, o bien
matar a esta bacteria con antibióticos
nuevos, pero el Dr. Prescott está a favor
de la inmunización.
“Creo que la vacuna probablemente sea
el enfoque más promisorio, porque
además será el más confiable. Me gusta
la idea de aplicar una vacuna por vía
oral, porque también se puede utilizar
para administrar otros antígenos y
productos”, dijo el orador, que además
ha venido realizando experimentos con
una vacuna oral atenuada de Salmonella,
utilizándola como vector de antígenos
de C. perfringens.
“Aun cuando todavía nos falta mucho por
aprender sobre la enteritis necrótica,
puedo prever un avance rápido en la tarea
de dominar la enfermedad, gracias a la
secuenciación del genoma a gran escala
y a otras tecnologías. Debido a estos
avances, los científicos que están
trabajando en el mundo sobre enteritis
necrótica han avanzado a pasos
agigantados en los últimos 3 ó 4 años,
en comparación con los 25 años
anteriores”, dijo.
La enteritis necrótica
es una enfermedad
compleja
Encontrar maneras de prevenir o controlar la enteritis
necrótica en los pollos de engorde no es tarea fácil, porque
Clostridium perfringens –su bacteria causal– tiene características
camaleónicas y, además, pueden estar involucrados otros
factores como por ejemplo el manejo.
En el Congreso Avícola Mundial realizado el verano pasado en
Brisbane, Australia, el Dr. John Prescott de la Universidad de
Guelph, llamó a C. perfringens “un malhechor absoluto”.
Esta bacteria está “adaptada perfectamente, como anaerobio
ambiental, para crecer muy rápidamente en los tejidos dañados o
necrosados de los animales. Pensemos que Escherichia coli duplica
su población cada 20 minutos. Por el contrario, C. perfringens es
el microorganismo con el desarrollo más rápido conocido, pues
bajo condiciones óptimas aumenta al doble cada 8 a 10 minutos”,
comentó.
“Está diseñada de manera excelente para sacar ventaja del tejido
dañado”, dijo. Secreta múltiples toxinas y enzimas para elevar al
máximo la destrucción de los tejidos.
La Dra. Joan Schrader, científica de Intervet/Schering-Plough
Animal Health, investigadora de la enteritis necrótica que ayudó a
desarrollar Netvax, Toxoide de Clostridium perfringens Tipo A de la
compañía para ser usada en pollos de engorde, está de acuerdo
(véase su artículo en la página 7).
“El C. perfringens virulento cuenta con todo un arsenal de toxinas
que puede producir y, dependiendo del ambiente en que se
encuentre, las utilizará de la manera que le resulte más ventajoso
dadas las circunstancias. Por ello, se trata en gran medida de una
enfermedad multifactorial”, indicó.
La Dra. Schrader hizo eco a la opinión del Dr. Prescott de que “la
toxina alfa es un factor clave, otras de las proteínas secretadas por
C. perfringens pueden estar involucradas en el desarrollo de esta
compleja enfermedad”, destacó.
Además, las proteínas secretadas por este germen pueden ser
solamente una parte de la historia.
En la plática que presentó en la OAPP el Dr. Prescott citó una
evidencia publicada de que los componentes de la dieta pueden
afectar adversamente la motilidad intestinal o dañar su mucosa, lo
cual a su vez afecta la producción de toxinas de C. perfringens o el
crecimiento de este germen. La infección por coccidias también
puede ser un factor contribuyente, aclaró.
“La interacción de [C. perfringens] con otros miembros de la flora
intestinal –incluyendo a aislamientos no causantes de enteritis
necrótica– y el efecto del resto de la microflora sobre la inmunidad
intestinal innata, también pueden ser factores importantes”, dijo.
Tanto él como la Dra. Schrader dijeron que no cabe duda de que la
enteritis necrótica es una enfermedad muy compleja.
El gen de la
toxina alfa se
viculv con
la enteristis
necrótica en India
Un estudio realizado con pollos de
India confirmó que Clostridium
perfringens tipo A era la causa de la
enteritis necrótica y que la toxina alfa
puede desempeñar un papel significativo
en el desarrollo de esta enfermedad,
dijeron Arunava Das y sus colaboradores
del Instituto Tecnológico Bannari Amman.
Después de la muerte de seis pollos de
engorde de 2 a 3 semanas de edad en una
granja avícola de Meghalaya, India, los
investigadores realizaron observaciones
con microscopio electrónico de barrido,
utilizando muestras de contenido intestinal
e hígado.
Estos análisis revelaron necrosis masiva y
destrucción completa de las vellosidades
intestinales. El aislamiento bacteriano
confirmó la presencia de C. perfringens
como causante. Las pruebas de reacción
en cadena con polimerasa (PCR) con
10 aislamientos clínicos mostraron la presencia del gen de la toxina alfa de
C. perfringens , cuatro resultaron positivas
al gen de la toxina beta 2 y ninguna a los
genes de las toxinas beta, epsilon, iota o
de la enterotoxina.
Todos los aislamientos derivados de casos
de enteritis necrótica correspondieron
a C. perfringens tipo A, observándose
de 97.6 a 100% de homología entre los
aislamientos de esta bacteria, según lo
que publicaron en un reciente número
del International Journal of Poultry
Science (Revista Internacional de
Ciencias Avícolas) (7 (6): 601-609, 2008).
Este estudio confirma que C. perfringens
tipo A es el más prevalente, en asociación
con la enteritis necrótica en los pollos de
engorde en esta región de la India, y que
el gen de la toxina alfa puede desempeñar
un papel significativo en la patogenia de
la enfermedad, en este tipo de aves,
concluyeron los investigadores.
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