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Diagnóstico viral: ¿servirá la nueva tecnología?
02 March 2012Los objetivos de la nueva tecnología en diagnóstico consisten en alcanzar la más alta sensibilidad y especificidad posibles para identificar con exactitud el estado de infección de un individuo o parvada en el tiempo más corto posible. La facilidad de uso, el bajo costo y el aumento en la cantidad de información proveniente de una sola prueba también son áreas críticas que a menudo representan objetivos para la mejora. (Segunda parte de una serie de dos artículos).
Ésta fue la Ponencia Houghton presentada en el XVII Congreso de la Asociación Mundial de Veterinarios Avícolas (WVPA) por Erica Spackman del Laboratorio de Investigaciones Avícolas del Sureste, Departamento de Agricultura de EUA. El Congreso del WVPA se llevó a cabo en Cancún, México en 2011.
(La autora no hace reivindicación ni respaldo alguno de cualquier tecnología o productos mencionados; tampoco es una revisión completamente integral de toda la tecnología).
Nuevas tecnologías
En el área de diagnóstico, el objetivo para una prueba es limitado: las proteínas o los ácidos nucleicos del agente, o la respuesta inmune específica del huésped para el agente objetivo. Los ensayos de detección pueden amplificar el objetivo o la señal para mejorar la sensibilidad. Los refinamientos y las modificaciones pueden mejorar sustancialmente la sensibilidad y especificidad respecto a las primeras pruebas.
Ahora tenemos la tecnología para detectar una sola molécula de ARN, ADN o proteína, incluyendo un solo virión. Debido a que hemos alcanzado lo que probablemente es el límite para la sensibilidad y especificidad, la tendencia en la tecnología consiste en mejorar la conveniencia (tiempo, costo, facilidad de uso, multiplexión, reutilizable o desechable), especializar hacia una situación específica (medicina "personalizada") y/o que pueda proporcionar información más profunda.
Los ensayos basados en PCR son las pruebas más comunes cuyo agente objetivo son los ácidos nucleicos y la mayoría de los ensayos de detección de proteína utilizan anticuerpos para la detección de un objetivo específico. Por supuesto, continúa el desarrollo de mejoras y modificaciones para cada tipo objetivo, lo cual aumenta la sensibilidad, especificidad e información, además de que puede reducir el costo y el tiempo necesario para obtener los resultados.
Para ser viable, las tecnologías menos exitosas deben realizar mejoras en numerosas áreas en comparación con cualquier prueba actual. La instrumentación es un área importante de desarrollo y los nuevos ensayos frecuentemente dependen de instrumentos específicos del estuche de pruebas (lo cual también se debe a la comercialización).
Detección del ácido nucleico
Existen numerosas tecnologías de detección del ácido nucleico disponibles: Basadas en PCR, amplificación isotérmica y microarreglo. Los ensayos basados en PCR son quizá los más ampliamente usados. Los ensayos para caracterizar aún más los ácidos nucleicos incluyen secuencias, microarreglo y RFLP, y por lo general se utilizan solo en laboratorios de referencia.
Los métodos de amplificación isotérmica, tales como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) y la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) se han utilizado durante años y tienen una ventaja debido a que no requieren termo-recicladores y las reacciones se pueden incubar en un simple baño de agua, por ejemplo. Estos métodos tienen sensibilidad y especificidad similares a la PCR, pero puede ser más costoso ejecutarlos.
Los microarreglos han sido propuestos como una herramienta de diagnóstico que puede proporcionar una gran cantidad de información, de forma tal que no solo se puede identificar el agente objetivo, sino que también se puede obtener información crucial tal como cepa, linaje, patotipo, etcétera.
Desafortunadamente, el microarreglo tiene una sensibilidad relativamente baja sin un enriquecimiento previo del objetivo, requieren más tiempo para su ejecución que los ensayos de PCR, y cuesta sustancialmente más. Si se pueden resolver algunos de estos problemas, los microarreglos serían una herramienta útil para los laboratorios de referencia.
Sin embargo, las secuencias de genes se han convertido en algo tan rápido y barato que son comunes en los análisis profundos de productos de PCR y pueden proporcionar mucha de la misma información que podría brindar un microarreglo. Actualmente, los microarreglos tienen la mayor utilidad diagnóstica para condiciones genéticas tales como el cáncer, en vez de enfermedades infecciosas.
Se han informado numerosas modificaciones para mejorar los métodos basados en PCR y muchas implican el mejoramiento de la sensibilidad y especificidad de la reacción. Las modificaciones más sencillas optimizan los parámetros de los ciclos de temperatura para explotar las características de la enzima y la plantilla.
Debido a los avances en la microfluidez en años recientes, se han desarrollado instrumentación mejorada de PCR y automatización de la reacción. Una innovación consiste en los cartuchos todo en uno/autocontenidos que extraen el ADN o ARN y ejecutan la reacción.
* "Quizá una de las preguntas más importantes es: ¿cómo se usarán los resultados?" |
Biosensores
Los biosensores son instrumentos que utilizan cualquier cosa, desde las reacciones químicas hasta la resistencia eléctrica para detectar analitos tan diferentes como los productos químicos hasta los virus y las bacterias. Hoy en día, los biosensores más disponibles comercialmente son para productos químicos, tales como drogas y explosivos, mientras que quizá los biosensores más comunes son los monitores de glucosa en sangre.
Se han informado biosensores para diversos virus utilizando ADN y proteínas virales como objetivos (Baeumner et al., 2002; Inoue, Arai y Aoyagi, 1999; Wang et al., 1996; Xu, Suárez y Gottfried, 2007; Zhou, Liu, Hu, Wang y Hu, 2002), pero ninguno ha sido adoptado clínicamente.
Si la tecnología se puede validar para los virus, los biosensores portátiles proporcionarían una ventaja sobre otras tecnologías, debido a que las muestras a menudo requieren mínimo procesamiento, lo cual las hace apropiadas para las pruebas en los puntos de atención. La mayoría son reutilizables o tienen un mínimo de consumibles, por lo cual los costos de las pruebas individuales debería ser bajo.
Líneas celulares reporteras
Las líneas celulares reporteras son líneas celulares que fueron modificadas para producir una señal medible cuando son infectadas por un virus objetivo. Por ejemplo, la línea celular del sistema inducible por virus vinculado a enzima (ELVIS) (Proffitt y Schindler, 1995), que está ahora disponible comercialmente se construyó para producir betagalactosidasa cuando está infectada con el virus del herpes simplex (HSV).
En algunos casos, las líneas celulares que naturalmente no serían susceptibles a una infección con un virus se pueden modificar para que sean susceptibles al insertarles el receptor apropiado.
Aunque las líneas celulares reporteras son específicas y sensibles, también son relativamente lentas y requieren un alto grado de habilidad técnica y recursos. Además, existe cierta limitación respecto a los agentes contra los cuales pueden ser objetivo.
Detección de una respuesta inmune específica
Un enfoque novedoso consiste en detectar la respuesta inmune anamnésica específica del huésped ante un patógeno, en lugar de al patógeno mismo. Un estuche disponible comercialmente que utiliza esta tecnología es una prueba de tuberculosis. Esencialmente la sangre del paciente se expone al antígeno proveniente del patógeno objetivo, después la prueba evalúa el nivel de interferón inducido proveniente de las células inmunes en la sangre.
La ventaja de este formato es que la infección activa y latente se puede detectar en los individuos que hubieran sido negativos utilizando las pruebas para el agente mismo (incluyendo cultivo) o el ácido nucleico del agente. En alguna forma esto es similar a las pruebas de aglutinación en tubo o placa usadas para el microplasma aviar, excepto que esto detecta la infección activa o latente en lugar del anticuerpo. Este formato probablemente no funcionaría bien para infecciones agudas.
* "Hay pocos informes sobre mejoras en la tecnología de recolección de muestras" |
Recolección, transporte y procesamiento de las muestras
Un área crítica, que ha sido largamente ignorada por los desarrolladores de pruebas de diagnóstico, es la recolección y el procesamiento de las muestras. Los métodos de muestreo para virus (es decir, medios, tipos de hisopos, transporte y almacenamiento de las muestras) se basaban originalmente en métodos bacterianos.
Existen relativamente pocos informes en la medicina veterinaria o humana acerca de estudios de validación de la recolección y transporte de las muestras. De igual forma, hay pocos informes sobre mejoras en la tecnología de recolección de muestras.
Dos notables tecnologías relativamente recientes son los hisopos con relieve y tarjetas FTA (Whatman Inc). Los hisopos con relieve consisten en un material de nylon que se supone tiene características superiores de captura y liberación, por lo cual mejora la sensibilidad al aumentar la cantidad de analito en la muestra (Daley, Castriciano, Chernesky y Smieja, 2006; Dalmaso, Bini, Paroni y Ferrari, 2008; Scansen et al., 2010).
Las tarjetas FTA han tenido probablemente el mayor impacto sobre la recolección y transporte de muestras que cualquier tecnología en la década pasada. Las tarjetas FTA se pueden usar para recolectar cualquier fluido que pueda ser colocado sobre la tarjeta.
Los productos químicos en las tarjetas inactivan a la mayoría de los patógenos y estabilizan el ácido nucleico; estar tarjetas se pueden después enviar con seguridad a temperatura ambiente y sin la clasificación de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo como un patógeno vivo, lo cual ahorra dinero.
Los ácidos nucleicos son extraídos de discos perforados de la tarjeta en el laboratorio de destino, los cuales se pueden procesar mediante cualquier ensayo de detección del ácido nucleico.
¿Qué significa la nueva tecnología para la salud avícola?
Independientemente de las capacidades tecnológicas, el mercado siempre determinará qué pruebas se implementan. Asimismo, el simple hecho de que podamos hacer algo no significa que sea necesario o práctico, por ejemplo, la sensibilidad hasta el punto de detección de una sola molécula.
¿La detección de un solo virión del virus de influenza aviar o de una célula de M. gallisepticum mejoraría realmente el control o lo complicaría? ¿La detección de una sola molécula es clínicamente importante? ¿Esto es necesario y se puede justificar el costo?
Las respuestas a estas preguntas varían por agente y situación debido a que la utilidad y el éxito de una prueba depende mucho en que ésta cumpla el propósito para el que se creó. Las necesidades varían entre los distintos compartimientos y regiones, así como si las pruebas son para la salud de la parvada versus la inocuidad alimentaria y el comercio, la importancia del objetivo de la prueba, etc.
Por ello, una prueba que funciona bien para la industria avícola en México, puede que no sea tan práctica para las ponedoras en los Estados Unidos. Esto deriva en quizá una de las preguntas más importantes cuando se implementa una prueba, y ésta se debe considerar durante el desarrollo: ¿cómo se usarán los resultados?
La observación de cómo se implementó la nueva tecnología en el pasado muestra una tendencia interesante, los métodos moleculares no han suplantando completamente a los métodos clásicos, tales como el cultivo.
El virus de la influenza aviar y el virus de la enfermedad de Newcastle son buenos ejemplos en los cuales las pruebas moleculares han mejorado la detección en el campo, de tal forma que se puede tomar una acción inmediata en el caso de una parvada positiva, pero el cultivo aún se requiere en la mayoría de los casos para una acción normativa y para caracterizar el virus presente.
Este paradigma, donde las pruebas moleculares y las pruebas en el punto de atención se utilizan como pruebas exploratorias y después se deben realizar pruebas confirmatorias adicionales (a menudo cultivos) se utiliza para numerosas enfermedades veterinarias y humanas.
La nueva tecnología añadida a nuestro arsenal en muchos casos no sustituye realmente a una prueba antigua. Esto probablemente es verdad con las innovaciones más recientes; los métodos moleculares se podrían modificar o remplazar, pero los métodos clásicos, específicamente el cultivo, no van a desaparecer.
En general, muchas tecnologías nuevas no serán adoptadas fácilmente debido al costo o a un formato impráctico. Sin embargo, si tuviéramos que seleccionar una de las tecnologías descritas antes como la más prometedora para los diagnósticos avícolas, el biosensor probablemente sería la mejor debido a que permitiría las pruebas en la granja misma.
Sin embargo, los biosensores se encuentran entre los más lejanos para su adopción (el desarrollo apenas está iniciando para la detección de virus y bacterias con biosensores).
La microfluidez también podría ser útil para que el laboratorio de diagnóstico aumente su capacidad y reduzca sus costos si el equipo es asequible.
A medida que algunas de las nuevas tecnologías se vuelven más baratas, las mejoras podrían justificar el costo de su adopción. Al menos, habrá mejoras definitivamente para los diagnósticos avícolas provenientes de las simples modificaciones que están disponibles para los ensayos de detección de ácido nucleico, incluso si es improbable que existan cambios sustanciales en el formato en el futuro cercano.
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Lea el primer artículo en esta serie "Diagnóstico viral: historia y capacidades actuales", al hacer clic aquí.
Marzo 2012
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