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Diagnóstico viral: historia y capacidades actuales
01 March 2012La tecnología para la detección de agentes infecciosos continúa evolucionando, particularmente los métodos moleculares que emergieron por primera vez a mediados de la década de los 70. (Primera parte de una serie de dos artículos).
Ésta fue la Ponencia Houghton presentada en el XVII Congreso de la Asociación Mundial de Veterinarios Avícolas (WVPA) por la Dra. Erica Spackman del Laboratorio de Investigaciones Avícolas del Sureste, Departamento de Agricultura de EUA. El Congreso del WVPA se llevó a cabo en Cancún, México en 2011.
Frecuentemente se informa sobre nuevas pruebas y modificaciones a las pruebas actuales; además las pruebas de diagnóstico las desarrollan comúnmente compañías comerciales. Como se podría esperar, la mayoría de los avances en tecnología de diagnóstico se aplican primero a la salud humana y después se pueden adaptar a la salud animal si resulta práctico. Aquí revisaremos las tendencias y las tecnologías innovadoras en el diagnóstico viral primario.
Se analizan brevemente la practicidad de estos métodos y su aplicación para la salud avícola. Además, parecería que la influenza está representada en exceso en los diagnósticos virales debido a que ésta se usa frecuentemente como un objetivo para la prueba de concepto de la nueva tecnología debido a su importancia para la salud animal y pública.
(Finalmente, la autora no hace reivindicación ni respaldo alguno de cualquier tecnología o productos mencionados; tampoco es una revisión completamente integral de toda la tecnología).
Una breve historia de los diagnósticos
La época clásica
Es interesante observar cuán rápidamente ha evolucionado la tecnología para el diagnóstico viral durante el siglo pasado. Sin embargo, algunos de los más antiguos métodos clásicos o moleculares aún están en uso, pero con algunas modificaciones.
Los virus se identificaron por primera vez como agentes filtrables en 1898, cuando Loeffler y Frosch descubrieron la fiebre aftosa. Los ensayos basados en anticuerpos constituyeron la primera época en el diagnostico viral. La fijación del complemento se describió en 1929 para diversos virus (Bedson). Weller y Enders desarrollaron el cultivo celular para las paperas y la influenza en 1948 y una prueba de anticuerpos fluorescente para la influenza se informó en 1956 (Liu).
La microscopía de electrones (ME) que usaba tintura negativa se describió por primera vez para la detección de virus en 1959 (Brenner y Horne). Una importante mejora para la ME ocurrió alrededor de 1967, cuando Best y sus colegas, describió el uso de un anticuerpo específico para mejorar la ME, conocido actualmente como ME inmune para la detección del virus de rubeola.
Los anticuerpos monoclonales, informados por primera vez en 1975 (Kohler & Milstein), representaron el siguiente gran salto tecnológico y abrieron el camino para pruebas basadas en anticuerpos mejoradas para la detección de virus.
* "El método de reacción en cadena de polimerasa (PCR) se informó por primera vez en 1985" |
La era molecular
Durante mediados de los 70, comenzaron a emerger los métodos moleculares cuando se describió el método Southern Blot. Actualmente el material se puede probar con ácidos nucleicos radioetiquetados para secuencias de ADN específicas (Southern, 1975).
Pronto siguieron métodos relacionados tales como el método Northern Blot (Alwine, Kemp, & Stark, 1977), los polimorfismos de restricción de longitud del fragmento (RFLPs) (Mears et al., 1978) y refinamientos del método original.
Aunque hubo algunos informes de la aplicación de esta tecnología para la detección de agentes infecciosos, nunca se adoptaron ampliamente los métodos Southern y Northern blot en los laboratorios de diagnóstico clínico debido a que son lentos, costosos y en aquél momento eran aún más complicados por la necesidad de usar radionucleidos para visualizar los resultados. Las ventajas potenciales de los métodos moleculares sobre los métodos clásicos no compensaban las desventajas.
El método de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) se informó por primera vez en 1985 (Saiki et al). En aquel momento las reacciones de PCR se debían realizar a mano; los tubos se movían manualmente entre baños de agua a distintas temperaturas para completar cada ciclo y era necesario añadir enzima de polimerasa fresca después de cada ciclo debido a que aún no se habían utilizado las polimerasas termoestables.
Las polimerasas termoestables se introdujeron en 1988 (Saiki et al.), lo cual también mejoró la especificidad de la PCR debido a que permitió temperaturas de ciclado más altas.
La PCR de transcripción inversa también se reportó por primera vez en 1988, e hizo posible fijar como objetivos a los virus de ARN (Rappolee, Mark, Banda, y Werb, 1988). Muy pronto después de su desarrollo, la PCR se aplicó a la detección al virus del papiloma humano (Shibata, Arnheim, y Martin, 1988) y la RT-PCR se aplicó para la detección del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (Hart et al., 1988).
Una prueba multiplex para la influenza A y B se presentó unos pocos años después (Fan, Henrickson, y Savatski, 1998).
La PCR en tiempo real, que visualiza los resultados a medida que la reacción se está ejecutando, se introdujo en 1996 (Heid, Stevens, Livak y Williams) y se aplicó por primera ocasión a los diagnósticos virales en 1999 cuando se informaron por primera vez pruebas para SV40 y Hepatitis B (Abe et al., 1999; Shi, Ho, Norling, Roy y Xu, 1999).
Pero al igual que las primeras pruebas moleculares, los métodos basados en PCR no fueron adoptados rápidamente por los laboratorios de diagnóstico clínico.
No es sorprendente que a medida que las tecnologías moleculares se han expandido, también se han multiplicado las compañías comerciales que producen pruebas; en 2011 había cerca de 350 compañías que fabrican pruebas médicas moleculares in vitro. Sin embargo, las pruebas moleculares comerciales se encuentran principalmente solo en el mundo desarrollado y el 79% del mercado se encuentra en Estados Unidos y Europa (Carlson, 2011).
Diagnósticos moleculares para enfermedades avícolas
El principio de la década de los 90 fue también el momento en que se introdujeron por primera vez los métodos de PCR para la detección de virus avícolas con pruebas para el virus de anemia infecciosa del pollo, el virus de bronquitis viral, el virus de la enfermedad de bursitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek, el virus de laringotraqueitis infecciosa y los virus de leucosis aviar (Jackwood, Hanes y Miller, 1996; Kwon, Jackwood, y Gelb, 1993; Stauber, Brechtbuhl, Bruckner y Hofmann, 1995; Tham y Stanislawek, 1992; Todd, Mawhinney y McNulty, 1992; van Woensel, van Blaaderen, Moorman, y de Boer, 1992; Williams et al., 1992).
La primera RT-PCR para virus de influenza aviar la reportaron Horimoto y Kawaoka en 1995, pero como un método para amplificar la HA para secuencias con objeto de evaluar el patotipo y no para la detección inicial del virus.
Además de identificar las parvadas infectadas, algunas de las primeras aplicaciones de los métodos de PCR para la salud avícola se orientaron a detectar contaminantes en las vacunas (Bruckner, Stauber, Brechtbuhl y Hofmann, 1996; Reimann y Werner, 1996).
Al igual que con la medicina humana, los laboratorios de investigación adoptaron la tecnología mucho antes que los laboratorios de diagnóstico.
Capacidades actuales
Los límites actuales de detección alcanzables son de una sola molécula: virión, proteína, ARN o ADN. Sin embargo, hay pocas pruebas con tal nivel de sensibilidad y especificidad disponibles clínicamente. En general, la adopción de la nueva tecnología va muy retrasada respecto a su desarrollo, de tal forma que la tecnología de punta no se correlaciona necesariamente con la práctica rutinaria.
Una razón es que existen numerosas barreras para la adopción que deben ser superadas para que cualquier nueva tecnología sea adoptada por los investigadores. Finalmente, debido a la amplia variación en los recursos y necesidades entre los laboratorios veterinarios (y de salud pública) alrededor del mundo, es difícil identificar un método o tecnología “estándar”.
Sin embargo, es obvio que tanto en la medicina veterinaria como en la salud humana, dos de los métodos más ampliamente usados para la detección de virus son los métodos basados en PCR en tiempo real (la PCR convencional también es común) y los cultivos de virus, dependiendo del objetivo.
También es interesante señalar una diferencia entre los laboratorios veterinarios y de salud humana, donde los laboratorios veterinarios van a la cabeza en la adopción de nueva tecnología.
Aunque los programas de diagnóstico veterinario, particularmente para animales de producción para consumo humano, por lo general no tienen los recursos de salud pública, los reglamentos menos estrictos pueden fomentar una adopción más rápida de nuevas tecnologías (y con frecuencia existen áreas grises debido a que los reglamentos van muy retrasados con respecto a la tecnología emergente).
En la salud pública, las pruebas de diagnóstico in vitro usualmente son estuches comerciales que a menudo requieren alguna forma de certificación (por ejemplo, en los Estados Unidos requieren aprobación de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA), mientras que en Europa requieren la marca CE-IVD).
En la medicina veterinaria las pruebas internas se usan mucho más comúnmente debido a que hay menos estuches comerciales porque el mercado es más pequeño, así que estos no siempre están disponibles (se debe observar que los estuches veterinarios comerciales a menudo requieren también una certificación).
* "El agente más enfocado por los estuches comerciales es el virus de influenza aviar" |
Falta de armonización de métodos
Sin embargo, esta libertad adicional también ha provocado que la armonización sea más difícil de alcanzar. Se ha establecido cierta armonización desde que la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE) fue capaz de recomendar métodos específicos para los agentes que provocan enfermedades conocidas.En los laboratorios de sanidad avícola, las pruebas internas (cualquier prueba que no está disponible como un estuche comercial, incluyendo ensayos publicados revisados por colegas y ensayos no publicados) suelen ser comunes, pero también es común el uso de estuches de prueba disponibles comercialmente como un indicador del nivel de tecnología en un laboratorio típico, los métodos clásicos y las técnicas moleculares básicas, tales como PCR.
Por mucho, el agente más enfocado por los estuches comerciales es el virus de influenza aviar (VIA) debido a su potencial zoonótico y debido a que es una de las enfermedades enumeradas por la OIE. En algunos casos, el mismo estuche para el virus de influenza aviar (influenza tipo A) comercializado para las aves también se ha validado y está disponible para humanos, cerdos, caballos, etcétera, y viceversa.
La comercialización de nuevos estuches para enfermedades avícolas probablemente será lenta debido a los mercados limitados en comparación con los de salud pública. Sin embargo, los agentes bacterianos que son importantes para la inocuidad alimentaria (por ejemplo, S. enteriditis, C. jejuni ) también han sido enfocados ampliamente para los estuches comerciales.
Entre las pruebas internas, los métodos basados en PCR en tiempo real son quizá el ensayo del día. En los diagnósticos veterinarios, la PCR en tiempo real es la prueba preferida para numerosas enfermedades enumeradas por la OIE (Hoffmann et al., 2009).
Actualmente, la RT-PCR en tiempo real es quizá la prueba más común para el VIA y el virus de la enfermedad de Newcastle, donde se utiliza como una prueba de exploración con el aislamiento del virus en huevos de pollo embrionados (ECE) que se utilizan como una prueba confirmatoria.
Las pruebas basadas en PCR también se utilizan para laringotraqueitis infecciosa y bronquitis infecciosa. Aunque se utilizan ampliamente los métodos basados en PCR, incluyendo el convencional y el de tiempo real, se han comercializado estuches para nuevos agentes.
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Lea el segundo artículo en esta serie "Diagnóstico viral: ¿servirá la nueva tecnología?", al hacer clic aquí.
Marzo 2012
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