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Diagnóstico y prevención de cólera aviar y coriza infecciosa
30 December 2011Para ambas enfermedades, hoy existen herramientas de diagnóstico rápido basado en moléculas que son adecuadas para los modernos laboratorios de diagnóstico. Al mismo tiempo, las tecnologías tradicionales basadas en cultivos siguen siendo pertinentes.
Esta información la presentó el Dr. P. J. Blackall de la Universidad de Queensland, en Australia durante el XXII Congreso Latinoamericano de Avicultura en Buenos Aires, Argentina, septiembre de 2011.
La dificultad con la coriza infecciosa es que el agente que la causa, Avibacterium paragallinarum, requiere medios con una variedad de aditivos caros. Para cólera aviar, están disponibles vacunas atenuadas e inactivas. Únicamente están disponibles vacunas inactivadas para coriza infecciosa.
Las investigaciones sobre los brotes de cólera aviar ahora pueden respaldarse con una variedad de metodologías de tipificación que permiten la identificación de las posibles fuentes, con estos métodos incluyendo la tipificación de secuencia multi-locus, ERIC-PCR, RFLP y ribotipado.
Menos opciones de tipificación están disponibles para los brotes de coriza. Si bien el serotipado es posible para ambos agentes, la capacidad para serotipado está limitada a unos cuantos laboratorios alrededor del mundo.
Coriza infecciosa- herramientas de diagnóstico
Como agente causante de la coriza infecciosa – Avibacterium paragallinarum – es un organismo demandante en términos de crecimiento en medios de laboratorio, los medios de cultivo usuales no son adecuados para esta enfermedad. El principal requisito de crecimiento es la necesidad del factor V (NADH).
Sin embargo, los encargados de los diagnósticos deben estar conscientes de que existen algunos aislados de Av. paragallinarum que no necesitan NADH (esto es, crecen en agar de sangre). Además, recientemente se encontró que algunos aislados australianos de Av. paragallinarum no crecerán en un medio completo que cumpla con los requisitos de NADH de los otros aislados Av. paragallinarum típicos.
* "En países como Sudáfrica y México, los ensayos de PCR son las herramientas para identificar cólera aviar" |
El medio de aislamiento más usado a nivel global para Av. paragallinarum sigue siendo 5% de agar de sangre ovina con una veta cruzada de un cultivo nodriza de Staphylococcus epidermidis para proporcionar el NADH requerido. Este medio ayuda en el reconocimiento de Av. paragallinarum ya que el organismo mostrará satelitismo (excepto si es independiente del NADH).
Se han utilizado medios completos que no muestran satelitismo, tal como el medio CLBA. El uso del medio CLBA no permite la incorporación de antibióticos selectivos que reducen el nivel de contaminación debido a organismos Gram positivo. Independientemente del medio usado, existe la necesidad de contar con una atmósfera con bióxido de carbono al 5%.
Después del aislamiento inicial, es necesario realizar un nivel de prueba bioquímica ya que hay un número de organismos satelíticos presentes en los pollos. Como mínimo, se requieren los siguientes resultados: organismo Gram negativo, catalasa negativo, organismo satelíticos de aves que muestren signos clínicos. Este nivel se puede lograr en la mayoría de los laboratorios de diagnóstico.
Una caracterización fenotípica más extensa (prueba de sensibilidad antimicrobiana, caracterización bioquímica detallada, serotipado) requiere acceso a los medios adecuados que puedan respaldar el crecimiento del organismo. Por lo general, este nivel de caracterización está disponible únicamente en un pequeño número de laboratorios.
Las bien reconocidas dificultades con el diagnóstico convencional – especializado, medios caros – han dado lugar al desarrollo de dos nuevos ensayos basados en ADN. El PCR convencional para Av. paragallinarum ha sido validado para su uso en aislados y directamente en las aves.
Un PCR en tiempo real también se ha descrito y validado para uso directamente en las aves. Para aquellos laboratorios que no tienen la experiencia en el manejo de organismos que requieren NADH, el uso de PCR es una alternativa atractiva.
De hecho, en regiones en las que se sabe que existe el Av. paragallinarum independiente de NAD (Sudáfrica y México), estos dos ensayos de PCR son las únicas herramientas prácticas para una identificación confiable de esta forma de Av. paragallinarum como una forma distinta de Ornithobacterium rhinotrachealae.
La principal desventaja con el uso de las pruebas de PCR es que no hay manera de obtener información sobre el serovar o la resistencia a los antibióticos.
Cólera aviar – herramientas de diagnóstico
La naturaleza robusta del agente causante del cólera aviar (Pasteurella multocida) significa que un simple medio de aislamiento (agar de sangre ovina al 5%) es el medio de elección. Se han descrito los medios selectivos para uso en hisopos laringotraqueales y cloacales, así como de muestras provenientes del tracto alimentario.
Las pruebas bioquímicas de confirmación se pueden realizar con relativa facilidad. Un punto clave para los diagnosticadores es que algunas de las características biológicas clave asociadas con el P. multocida típico – índole positivo, imposibilidad de fermentar la maltosa, presencia de decarboxilasa ornitina y son requisito de NADH – pueden variar.
Se han descrito una variedad de ensayos PCR específicos para las especies de P. multocida – con dos ensayos bien validados para uso en los cultivos. Ninguna de estas pruebas ha sido validada para uso directo en los tejidos. Sin embargo, un PCR en tiempo real ha sido desarrollado recientemente que ha demostrado ser tanto específico para la especie como adecuado para usarse directamente en los hisopos.
Coriza infecciosa – prevención con vacunación
En años recientes, ha habido un enfoque significativo en la protección cruzada (dentro de un serovar) proporcionada por las vacunas inactivadas de coriza infecciosa. Existe amplia aceptación en la actualidad de que los serovares Page (A, B y C) no realizan una protección cruzada. El enfoque en tiempos recientes ha sido un tema de la protección cruzada con los serovares A, B y C.
Por algún tiempo, se ha sabido que no todos los aislados de serovares B brindan protección cruzada. Esto ha alcanzado la etapa en la que las vacunas comerciales ahora incluyen varias cepas B.
Si bien sólo las vacunas de coriza de célula compleja muerta siguen siendo las únicas vacunas disponibles comercialmente, ha habido investigación activa sobre los posibles enfoques alternativos.
Varios estudios han mostrado que los antígenos de hemaglutinina recombinante pueden proporcionar protección (aunque solo se han probado a la fecha para protección de serovar homologa). Adicionalmente, un péptido ha demostrado ser capaz de proporcionar protección homóloga. Si los resultados de esta investigación se pueden convertir en productos comerciales sigue siendo una pregunta abierta.
* "Hay un enfoque en la protección cruzada para las vacunas inactivadas de coriza infecciosa" |
Cólera aviar – prevención con vacunación
A diferencia de coriza infecciosa, ambas vacunas atenuada e inactivadas para cólera aviar han estado disponibles durante algún tiempo en los Estados Unidos. En Australia, se acaba de liberar una nueva vacuna, la primera vacuna activa en ese mercado. La situación generalmente aceptada es que las vacunas inactivas proporcionan protección contra los serovares en la vacuna (por lo general serovares 1, 3 y 4) mientras que las vacunas atenuadas (usualmente una sola cepa) proporcionan protección a través de los serovares.
En muchas regiones, sigue habiendo un uso amplio de vacunas autógenas – aislados de una granja que se usan para una vacuna específica para ésta. Si bien no son la opción preferida por algunos fabricantes de vacunas, este enfoque se basa en la creencia de que la mejor protección para una vacuna inactiva la da el aislado responsable del desafío.
Existen una serie de avances en la investigación realizados en años recientes que pueden anunciar el advenimiento de una nueva era en las vacunas para cólera aviar. Como ejemplo, se ha demostrado recientemente que un solo cambio en el nucleótido en una proteína asociada con un nucleoide (la proteína FIS) es una explicación para la pérdida espontánea de la cápsula.
Además, este gen (el gen fis) parece desempeñar un papel central en la regulación de los factores virulentos y los componentes de la superficie de la bacteria. Claramente, este entendimiento del desarrollo de los principales mecanismos de regulación de virulencia podrían llevar a la siguiente generación de vacunas contra cólera aviar.
Herramientas de apoyo de laboratorio
Tanto para coriza infecciosa y cólera aviar hoy existen una variedad de herramientas para ayudar a guiar las investigaciones de la enfermedad y mejorar los programas de prevención y control. Para coriza infecciosa, las herramientas disponibles actualmente son limitadas – análisis de restricción de endonucleasa, ribotipado y ERIC-PCR. Mientras que estas herramientas han probado ser útiles, aún no han sido adoptadas o usadas ampliamente.
Para cólera aviar, hoy existe una amplia variedad de herramientas de tipificación, incluyendo el análisis de restricción de endonucleasa y REP-PCR, que son bastante adecuados. La principal adición para el conjunto de herramientas de tipificación es la tipificación de secuencia multi-locus (MLST). MLST ahora está ampliamente aceptada como una herramienta de tipificación definitiva.
El estudio original que define el esquema MLST mostró que la metodología tenía una buena capacidad para investigar la epidemiología de los brotes de cólera aviar.
Conclusiones
Ha habido nuevas tecnologías significativas que se han desarrollado para las pruebas de laboratorio para ayudar en el diagnóstico y prevención tanto de cólera aviar como de coriza infecciosa. Si bien estas nuevas tecnologías juegan papeles importantes, el enfoque tradicional del cultivo y la caracterización fenotípica sigue siendo una opción válida e importante para las investigaciones de diagnóstico.
Al igual que con todas las enfermedades, un diagnóstico y un programa de prevención y control requiere la participación de una gama completa de experiencia y habilidades – veterinarios de campo, diagnosticadores de laboratorio y patólogos.
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Existe un sitio Web en inglés que permite acceder a los resultados de la tipificación de más de 450 cepas de Pasteurella multocida y que se amplía regularmente: pubmlst.org/pmultocida_rirdc/
Diciembre 2011
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